5·低温生物学与胚胎冷冻保存技术  

低温生物学是一门在低温下研究有机体、器官、生物组织和生物细胞形态和功能的科学。它的历史可以追溯到公元前2500年左右的古埃及，当时的医生将低温用于止血和消肿。  低温生物学中的一个应用就是冷冻保存技术。1949年，英国科学家第一次将它应用于精子的冷冻保存。从此以后冷冻保存技术更加广泛地开展起来。大的器官，如心脏，可以短时间低温保存以便运输到其他地方进行心脏移植。细胞悬浮液  如血液和精液，可以在超低温下长期保存。

l984年，第一个来自冷冻胚胎的试管婴儿在澳大利亚出生了。随后，冷冻胚胎移植成功的报道在许多国家的试管婴儿中心相继出现。目前，冷冻胚胎的移植已经成为一个常规的试管婴儿技术。成千上万的已通过冷冻胚胎移植的试管婴儿出生。据估计大约有20％的试管婴是由移植冷冻胚胎而出生的。

1. 胚胎是如何冷冻的  

     胚胎可以在受精后的任何一个阶段用于冷冻，即从1个细胞的受精卵到100个细胞左右的囊胚都可以冷冻保存。细胞在冷冻时，细胞内的水分向外溢出，细胞外面形成冰块，  而这些冰块能机械性地损伤细胞。细胞内部结冰也会导致细胞死亡。因此细胞内的水分必须用能防冻的化学药品(生物学上称为防冻剂或冷冻保护剂)来取代．不让细胞周围和细胞内部在冷冻过程中形成冰块。

  如果细胞内的水分在冷却前溢出，冷冻时，细胞的周围和内部就不会产生冰晶，细胞就不会被损伤，等到细胞内的水分完全被冷冻保护剂取代以后，把胚胎装入细小的麦管或小容器．然后在计算机的控制下，将其温度从室温逐渐降到零下35~40℃左右．然后将装有胚胎的麦管直接放到零下196℃的液氮罐中长期保存。   

在液氮罐内，每个麦管或容器都标明患者的姓名、胚胎的数量、发育阶段、冷冻的时间等。因此，患者之间的胚胎是不会混淆的。并不是所有做试管婴儿的患者都需要考虑胚胎冷玲冻．这取决于多余胚胎的数量和质量。一般而  言，50％左右的胚胎是可移植或冷冻的。如果只有2或3个胚胎，那么，移植后就没有多余的胚胎用来冷冻。另外，即使有的患者有很多胚胎．如果胚胎的质量不好，也没有冷冻保存的必要。

1. 冷冻胚胎是如何移植的  

 冷冻胚胎的移植分两个步骤，胚胎的解冻和移植。冷冻的胚胎必须解冻后才能移植到体内。解冻是一个将零下196的胚胎在相当短的时问内升温到20～30℃的过程。胚胎解冻时，需要将细胞内的冷冻保护剂用水分置换出来。胚胎解冻后，需要在庄培养液内培养一定的时间来检查胚胎的存活状况和发育状况，如果胚胎存活并继续生长，这些胚胎可移植到患者体内。移植方法与新鲜胚胎完全一样。如果患者的胚胎较多，也不必要将所有的胚胎解冻。一般来说，如果有3个左右的胚胎在解冻后存活．也就没有必要解冻更多的了。   

3）冷冻胚胎能保存多久

  理论上讲．由于胚胎在零下196℃的环境下，代谢完全停止，所以能够永远保存。但是,自从胚胎冷冻技术的出现到现在为止，仅仅只有大约20年的时间。据报道．在以色列，  一名39岁的妇女移植了她冷冻保存12年的胚胎后，出生了正常的婴儿。这也是迄今报道的最长期保存的冷冻胚胎移植的试管婴儿出生的例子。也许有些胚胎已经冷冻保存了更长的时间，但却仍然没有被解冻移植，因此，它们的存活状况  暂且无法得知。

4)冷冻胚胎的时期和存活率

 胚胎可以在任何时期冷冻保存。但目前最常用的是第3 天的胚胎和第5天或第6天的囊胚，人们选择这两个时期是由于胚胎移植一般是在第3天、第5天或第6天进行。移植后剩余的胚胎就需要冷冻保存起来。冷冻胚胎的存活率一般与胚胎的时期没有很大关系。      

冷冻胚胎的存活率也是检验一个试管婴儿实验室好坏的标准。因为胚胎冷冻-解冻是一个复杂的过程,有许多环节，包括冷冻液的配制、冷冻保护剂的选择、浓度、冷却时的速度。解冻时的温度变化等都需要一定的技术和经验。如果任何一个环节出了问题，胚胎就会在解冻后停止发育或在解冻过程中死亡。

   由于目前的冷冻方法和程序已接近半自动化，冷冻胚胎的存活率一般在80％以上以至于90％以上。近年来改良的玻璃化冷冻能使胚胎的存活率达到95％以上。

5)冷冻胚胎和新鲜胚胎移植，哪个更好

  许多患者都会提这个问题。这个问题必须从两个方面看：胚胎方面和患者方面。

从胚胎方面来看，应该是新鲜胚胎更好。如上所述，胚胎冷冻后，只要存活并继续发育，应该是没有问题。但是，胚胎在冷冻—解冻过程中，有可能在不同程度上出现损伤，一旦损伤程度较大，那无疑会影响胚胎的正常发育，那么移植后胚胎有可能不能继续发育和着床。

  从患者角度看，也是一个复杂过程。因为新鲜胚胎移植是在患者用了各种激素和药物后进行的。这些激素和药物也许对她体内的内分泌环境没有明显的影响，这样．新鲜胚胎的移植就不会有任何问题。而有些患者在激素和药物处理后，会造成一定程度的内分泌暂时紊乱．她的子宫也许没有与胚胎的发育同步进行。如果出现这种情况，新鲜胚胎移植后的成功受孕率就会受到影响。如果将胚胎冷冻保存，等到激素和药物的反应消失后再做冷冻胚胎的移植．成功率会更高一些。  

 6)已怀孕的妇女的冷冻胚胎将来如何处理  

 可以选择以下几个方案：  

 (1)继续保存。一般情况下。试管婴儿中心会收取一些保管费。如果这个费用不是很大，不会影响家庭经济的话，也许是大多数人的选择。

   (2)捐献给其他不孕患者，包括亲戚、朋友或完全不认识的人，以帮助这些患者达到怀孕，拥有小孩的目的。

  (3)捐献给研究机构。人类胚胎研究材料一直短缺，特别是人类胚胎干细胞的研究需要大量的胚胎才能进行。

  (4)丢弃。如果你不愿意以上几个方面的选择，可告诉实验室将剩余的胚胎丢弃。实验室会有自己的方法来处理这些胚胎。

无论是哪种处理方法，实验室会让患者签署一些书面材料，以避免将来引起争议，以致官司。

1. 胚胎着床前基因诊断技术

胚胎着床前基因诊断技术是一个最早期的产前诊断。它包括对受精前的卵子或者移植前的胚胎进行整个染色体或某一个基因的诊断。它的主要优点在于避免由于疾病或先天缺陷而造成的妊娠终止和避免携带遗传病或不健康的婴儿诞生。它是一个附加的试管婴儿技术。在我国又叫第三代试管婴儿。它的前提是，必须通过试管婴儿技术来获取卵子和胚胎。  

 早在1967年，英国科学家用此项技术开始鉴别动物胚胎的性别。但是，直到20世纪80年代，人类试管婴儿技术的出现和当时基因检测技术的发明，胚胎着床前基因诊断才开    始使用并逐渐广泛应用起来。1992年第一个经胚胎着床前基因诊断的试管婴儿出生了。自此以后，用这种技术出生的试管婴儿已有上千人。

但是，这项服务不应该用于所有的不孕患者，而应仅限于一些特殊的患者。

目前。胚胎着床前基因诊断可以应用于以下两个方面：

1. 高风险遗传病和先天缺陷患者，这些患者一般没有不孕问题，只有遗传缺陷。遗传缺陷婴儿大约占整个出生婴儿的5％。从微小的解剖学异常到广泛的遗传病或者精神发育迟滞都有。一些夫妇生育带有先天缺陷孩子的危险性要比其他人大得多。由于夫妇的种族、家庭和病史不同．这些缺陷的遗传性也不一样。

  许多种族相关和家族相关的遗传病，如镰状细胞贫血、囊性纤维症、地中海贫血症、泰萨二氏症、唐氏综合症、肌肉萎缩症、神经纤维瘤病、血友病或者其他出血性病症、精神发青迟滞、神经管畸形、自主神经障碍都可以带有遗传性。这些有阳性家族遗传病史的夫妇，更容易生育染色体不正常的婴儿或者流产。

因此在怀孕前，这妇女最好咨询她们的医生或者是遗传学专家，来确定胎儿染色体异常的几率。如果自然生育时婴儿的染色体异常的几率较大，可以选用试管婴儿和胚胎着床前基因诊断技术。这项技术能够检测出染色体不正常的胚胎从而在胚胎移植时，只移植那染色体正常或基因正常的胚胎。这样一来，将来出生的小孩就不会带有遗传缺陷。

(2)接受试管婴儿治疗的患者也可通过此项技术来筛选那些染色体异常(医学上称非整倍体)的胚胎，从而移植染色体正常的胚胎来增加怀孕的几率。这些患者包括年龄大的妇女，有习惯流产历史或胚胎不能着床的患者。

  非整倍体的筛选是目前应用最广泛的胚胎着床前诊断。其原因有以下几点：①染色体的异常与大多数的流产有关。②人的胚胎有相当大的部分是非整倍体。非整倍体是指胚胎的染色体不是23对，其中有一些不成对，如有三条，或只有一条，或两条都缺，或染色体的某一片段有异常。

  非整倍体将影响胚胎的发育，有的胚胎在着床前停止发育，造成胚胎无法着床；有的胚胎可能着床，但是胎儿不能继续在子宫发育，因而造成流产；有的胚胎可能着床，并能继续发育到胎儿出生，但出生的胎儿有先天性的异常。

  胚胎着床前诊断的操作简单地说有两个方面：胚胎的活检和诊断。胚胎的活检是指将卵子的两个极体或者胚胎的其中一个卵裂球在显微镜下分离出来。然后，卵子继续受精，胚胎继续培养。而分离得到的卵裂球通过其他技术进行诊断来确定是否是正常的胚胎。

  目前应用的诊断方法有两种：一种叫原位杂交法，它主要用来检查非整倍体的胚胎，和某些染色体的异常；另一种就是PCR技术，它主要是用来检测某些基因的异常。非整倍体的检测可以检查所有的染色体，但是大多数实验室只检测最常见的染色体的异常,如21号、13号、l8号、x和Y染色体。而基因诊断并不能检测所有的基因异常。因此，如果有特殊检测需要，必须与试管婴儿中心联系确定是否可以检测某种特异的基因异常。          胚胎着床前诊断的准确率很高，几乎是100％，但是检测后的胚胎移植的怀孕率仍然不是很高。这与胚胎的活检技术、患者的年龄、胚胎的质量等有关。由于患者用这一技术出生的小孩都是健康的，因此可以说这也是个优牛优育的高科技手段。

7．癌症与生育能力的保存

  在美国，大约有800000处在生育年龄的男性和女性癌症患者。在我国处于生育年龄的男性和女性癌症患者数量可能也很高。随着医疗技术的迅速发展，癌症患者的治疗成功率也在不断提高，很多患者在治愈后都能拥有正常的生活。 他们中的多数人都很关心自己的生育能力。然而癌症的有x治疗方法。如放射性治疗，可能会破坏卵子或精子的发生和成熟。从而降低这些癌症患者将来的生育能力。

  这种破坏与患者的年龄、性别及治疗的方式和时间长短有关，其中最严重的就是对卵巢和睾丸的放射性伤害及使用一些治疗癌症的药物所带来的不良后果。尽管精子的产生在某种程度上是可以恢复的，但是卵子的产生却是不可再生的，这种损失将是永久性的，而且可能还会引发更年期的提前到来。当然，治愈癌症是首要目标，但它很有可能引发不育症，使这些癌症患者在治愈癌症后可能不再拥有自己的孩子。

  对此，医疗工作者已进行了大量的研究和努力。可喜的是目前已有很多方法可以帮助这些病人在治疗癌症之前保存生育能力。

  对于男性来说，在放疗或化疗之前，可以将精子冷冻，然后存放于精子库或者生殖中心，以便将来使用。如果有些癌症患者已接受治疗，受其结果的影响，精子数目可能会减少。如果精子数目减少或者冷冻精子数目有限时、可以使用体外受精和显微授精的试管婴儿方法米解决未来可能出现的不孕问题。如果精子数量仍然很多，将来可以选择人工授精和其他简单的辅助手段助孕。

   对于女性来说，问题就要复杂很多。需要考虑许多方面的因素，比如时间、花费及癌症治疗的日程等。可归纳为以下几个重点考虑的方面：  

 1)冷冻胚胎    如果是已婚妇女，时间和条件允许的话，可以考虑使用体外受精技术来产生胚胎，然后将胚胎冷冻存放在试管婴儿中心。这样可能会延迟癌症治疗，但如果这种延期不会影响癌症治疗，那么可在将来恢复健康后再做冷冻胚胎的移植。

 2)冷冻卵子  如果是未婚女性，时间和条件允许的话，也可以考虑像冷冻精子一样冷冻卵子。这样也可能会延迟癌症治疗。当然这种延期的前提是不会影响癌症治疗。冷冻卵子技术目前还处在比较初级的阶段。理论上，冷冻的卵子可以储存和解冻，用体外受精的方法产生胚胎，然后进行胚胎移植。应用这种方法取得成功的例子也逐渐增多。将来，这种技术会区域更加成熟，它必将为那些需要帮助的人们提供服务。

  3)冷冻卵巢组织    如果癌症患者需要及时治疗，而且是需要对骨盆区域进行放射性治疗，这就需要考虑通过手术将卵巢取出放疗区域从而降低射线对卵子的伤害，然后将卵巢组织冷冻保存。这种处于试验中的技术需要使用外科手术将卵巢切除，然后再冷冻保存起来。冷冻的卵巢组织可以储存许多年。初步研究表明，这种移植的卵巢组织只能在很短的时间内存活并发挥功能。但是，成功的报道已为这项技术在将来的应用提供了良好的前景。

8．卵子的体外成熟技术

如前所述，体外受精用的卵子99％以上是体内成熟的卵子。而卵子的体内成熟是在许多外来激素的调节下完成的。然而，有些病人对外来激素非常敏感，很可能会出现一种叫做卵巢过度刺激综合征的副作用。卵巢过度刺激综合征有时是很危险的。另外，重复和长期使用这些外来激素会有增加卵巢癌和乳腺癌 的机会。因此，人们试图让这些病人用体外成熟的方法叫做卵子的体外成熟技术。其实，卵子的体外成熟技术在动物上已有广泛深入的研究并且取得了非常好的结果。第一例用体外成熟卵子的试管婴儿于1991年成功。

  由于体外成熟培养液的不断改进，卵子体外成熟后的质量也越来越好，虽然与体内成熟卵不能完全相比，但对某些特殊患者来说，比体内成熟卵有更多的好处。它不会出现像使用激素所引起的卵巢过度刺激综合征。另外，不需要激素的处理，还可节约一笔药费。临床上，主要用于患有多囊卵巢综合征的病人，因为这些病人对外来激素比较敏感。

当然，其他不孕患者也是可以接受体外成熟卵的试管婴儿治疗。目前，由于体外成熟卵子的质量与体内成熟卵相比还有一些差距，因而没有被广泛应用。目前采用这种技术获得的试管婴儿全世界也就300多例。但是，在不久的将来，随着培养条件进一步改良，卵子体外成熟技术有可能会代替体内卵子成熟技术广泛地应用于不孕症的治疗。